Нобелевские по химии — эволюция, женщины

Изменено: 22.12.2018 Posted on

см.Нобелевская химия 2018

Н.химия включает «операторы» и носители чисел-умножения энтропии и реакций (х.р., где их признаки — выделения газа/осадка выражают рост энтропии/энергии связи) и отбора — направленной эволюции числа возможностей химии от молекул до создания искусственной жизни — биоинженерии промышленно и медицински значимых белков in vitro, антител с большей аффинностью в 2018 г.- Френсис Арнольд получила премию за развитие ферментов, катализа реакций, Джордж Смит и Грегори Уинтер — за создание лабораторного метода изучения белковых и НК- взаимодействий — «фагового дисплея», выбора биомолекул с нужными свойствами. Арнольд в разные отрасли технологии «включила» эволюции белков, участвующих в реакциях органического синтеза, научила кишечную палочку производить каротиноиды и необычные аминокислоты, основала свою компанию по производству биотоплива и даже придумала более дешевый способ синтеза лекарства от диабета. Она отбирала белки, лучше вступавшие в интересующие ее реакции, Смит узнавал неизвестные гены на дисплее и с помощью антител, а Грегори Уинтер, наоборот, отбирал не белки, а антитела с помощью белков. Он вводил в геном бактериофагов последовательность ДНК, кодирующую чувствительную — вариативную часть антитела, антиген-связывающую область, чтобы вирусы покрывались фрагментами антител, обрабатывал их белком и отбирал связывавшиеся лучше, для эволюции антител в пробирке -дисплее, с библиотекой фагов. Он использовал белки как рыболовный крючок ловли фагов с определенными антителами (они прикреплялись к белкам), со случайными мутациями, разрабатывал антитела как лекарство. В 2002 году было одобрено первое из них, Адалимумаб, для лечения ревматоидного артрита, псориаза и воспалительных заболеваний кишечника

Фаговый дисплей — только один из бес-клеточных «дисплеев» и связи гено-фенотипа, «омик», нуклео-протеидов «сенсорной волны».

Идеи «фаговой группы» (Мах Д.- Гамова), бактериофагов — вирусов бактерий как связей между белками и участками ДНК, которая их кодирует, использовал и Смит в 1984. Вставляя ген белка в фаг, инфицировал клетки бактерий и умножал их во внешней оболочке вируса, прикреплял к целевым молекулам на планшете. Сэр Грегори Уинтер применил их для создания новых фармацевтических препаратов,  антител против токсинов, аутоиммунных болезней и рака на стадии метастаз.

Френсис Арнольд — пятая женщина-лауреат Нобелевской премии по химии — амер.инженер,  Смит — с Ун.Миссури, а Грегори Уинтер — британский биохимик, белковый инженер Кембриджа. В университете он думал стать биологом: «чистая» химия не прельщала задачами, биология же пытается ответить на другие вопросы — ранняя эволюция, происхождение жизни, требующие химических методов, построил свою научную карьеру на использовании химии для исследования биологических проблем. «Впрочем, в глубине души я все-таки химик. Химик, который очень хорошо разбирается в биологии…в этой области, я даже не мог найти финансирование и лабораторию — банально физическое пространство для работы. Академическое сообщество вначале не оценило мою работу, и денег от государства я получить не мог. Бизнес тоже не инвестировал: традиционные фармацевтические компании не понимали, зачем им это делать. В итоге я нашел небольшую биотехнологическую компанию из Австралии, они и профинансировали разработки…поверили …я понимаю, что благодаря науке после смерти я оставлю этому миру гораздо больше, чем если бы я занимался чем-то другим. Благодаря нашим исследованиям меняется мир: люди излечиваются, получают шанс на здоровую жизнь. Нобелиат по химии: «Когда я узнал, я испытал облегчение — наконец-то начнется новая жизнь!»Химия и науки о материалах В Великобритании, я и так находился достаточно высоко в научной иерархии. Я занимаю должность главы кембриджского Тринити-колледжа, ношу титул рыцаря-бакалавра (посвященного, не входя в рыцарский орден)…новый уровень… подготовкой Нобелевской лекции …гораздо больше возможностей реализовать свои планы, премия поможет мне приблизиться к моим следующим целям…. имитаторов антител — могут связываться со специфичным антигеном…У меня небольшая компания, Bicycle Therapeutics, и мы как раз занимаемся поиском химических соединений, которые могут имитировать антитела. И, кстати, они могут стоить дешевле антител, потому что получаются при помощи химического синтеза. Indicator.Ru — Терапия моноклональными антителами довольно дорогостоящая ..до $400 000. …дешевле для лечения остеопороза, курс лечения находится в пределах $1000, за счет химической обработки антител. .. Если на рынке антител есть конкуренция, то стоимость препаратов постепенно снизится …биоподобные лекарственные препараты. Для антител это как дженерики для обычных лекарств. ..качественное, полноценное лечение, оно хорошо переносится, не имеет побочных эффектов и, главное, избавляет от болезни. Стероиды, например, тоже хороши, но у них очень сильное побочное действие, люди могут просто ужасно себя чувствовать после их использования.

Фрэнсис А. — дочь ядерщика (William Howard Arnold — physicist — первые родственники-члены Национальной инженерной академии США) и внучка генерала (William Howard Arnold[en]), бегала на протестные акции против войны во Вьетнаме, ушла из дома, в колледже училась плохо, подрабатывая барменом и таксисткой, но поступила в Принстон, на факультет аэрокосмической техники (куда было проще поступить), бросила учебу на год, переехала в Италию и устроилась на фабрику по производству ядерных реакторов, «по линии отца», больше не собиралась заниматься наукой, но увлеклась «зеленой» энергетикой. Когда арабские страны в 70-е взвинтили цены на нефть, в США разразился самый тяжелый экономический кризис со времен Великой депрессии, президент Картер учредил министерство энергетики, велел установить солнечные панели на Белый дом и задачу к концу века слезть с «нефтяной иглы». Арнольд занялась солнечными панелями, в лекции 2017-го  вспоминала: «У моей страны когда-то была цель — 20% энергии из возобновляемых источников к 2000-му… печально, что мы ее бросили». Рейган сменил солнечные планы прежнего президента, и Арнольд искала новые «зеленые» инновации, поступив в Калтех на факультет химии, нефтяной индустрии противопоставив «рациональный» дизайн новых соединений и ферментов, получения энергии менее токсичным путем, техникой природы, эволюции белков. Магистр химической инженерии Беркли разочаровывается в возможностях человеческого разума в сравнении с природой: «Вы тратите два года, у вас ничего не выходит, вы начинаете с начала», «25 лет назад это (инженерия направленной эволюции белков) считалось безумием. Ученые подобным не занимались, джентльмены подобным не занимались. Но, поскольку я инженер и не джентльмен, меня это не заботило», — вспоминает она.

Получить нужный нам биологический объект, как это делает природа, эволюцией, нужны объекты отбора, фактор создания разнообразия и сила отбора. Объект нобелевских 2018 — белки теперь умеют синтезировать без помощи клеток, а тогда требовался живой организм, бактерии: они быстро размножаются и в их ДНК научились включать нужный ген, проще клеток эукариот, от растений до человека и мыши, где ДНК защищена ядром. Бактерии могут размножать и вирусов — бактериофагов, чья ДНК устроена еще проще, меньше и легче поддается манипуляциям, а нужные белки выходят как вирусные частицы из зараженных клеток [2][3].

В 1993 году она получила фермент субтилизин Е — протеазу сенной палочки, — активную и в присутствии органического растворителя диметилформамида (ДМФ). С помощью метода склонной к ошибкам ПЦР [4] она вносила в ген мутации, а затем клонировала и экспрессировала его с помощью бактерий, отбирая с помощью селекции клоны, способные гидролизовать молочный белок казеин в присутствии ДМФ (рис. 1). Вокруг тех колоний бактерий, чей встроенный фермент гидролизовал казеин, на чашке образовывалось гало. Микроорганизмы с самым большим гало отбирали и подвергали следующему раунду мутагенеза—клонирования—отбора, повысив устойчивость к ДМФ в 256 раз [5]

Метод направленной эволюции ферментов
Рисунок 1. Метод направленной эволюции ферментов. 1. Внесение мутаций в ген, подлежащий модификации. 2. Встраивание генов в бактериальные векторы и их экспрессия в клетках бактерий. 3.Тестирование измененных ферментов по необходимым критериям. 4. Новый раунд внесения случайных мутаций. Цикл повторяется.

Ее метод был подхвачен и получил необычайно широкое распространение в биоинженерии, химии, биологии, для управления функциями ферментов и создания их с улучшенной специфичностью, активностью, стабильностью и растворимостью, а также устойчивостью к различным условиям производственного процесса [2]. Ее новшества  — работа с геном напрямую, внедряя его после склонной к ошибкам ПЦР в бактериальные векторы, эффективнее для поиска ферментов с необходимыми свойствами. Природа же бракует новое, не способствующее выживанию, но в пробирке с бактериальным вектором можно получить молекулу с любыми необходимыми свойствами, быстрее и эффективнее самóй биологической эволюции.

Метод выращивания белков в бактериях важен в самых разных областях. Арнольд «эволюционировала» множество белков органического синтеза, научила кишечную палочку производить каротиноиды и необычные аминокислоты, основала компанию по производству биотоплива и даже придумала более дешевый способ синтеза лекарства от диабета.

Награды Linus Pauling Professor of Chemical Engineering, Bioengineering and Biochemistry Калтеха,- член Инженерной (2000), Медицинской (2004) и Национальной Академии наук(2008)[2]США, академии микробиологии (2009), ассоциации содействия развитию науки (2010), ам.академии искусств и наук (2011)[4]Американского философского общества (2018)[3] , с Национальной медалью в области технологий и инноваций (2013) введена в Национальный зал славы изобретателей (2014), первая женщина с Премией Чарльза Старка Дрейпера Национальной инженерной академии США (2011) и «Технологии тысячелетия», Технологическая академия Финляндии (2016)

here to see current on-line database,  the students chronologic…Frances Arnold has 2 students and 2 descendants.

Name School Year Descendants
Bloom, Jesse California Institute of Technology 2007
Drummond, David California Institute of Technology 2006

Чтобы создать разнообразие белков, чтобы эволюции было, из чего выбирать, нужно внести в ДНК исходного белка разные мутации, отличия, потом сравнивать их форму и свойства и отбирать более подходящие, заниматься селекцией. Однако исходный белок должен уже проявлять нужные способности

Группа Арнольд занималась выведением белков со специальными свойствами, умеющих производить топливо в безвоздушном пространстве — более экологичное, активироваться под действием света — встраивать в клетки тканей, мозга и активировать их световыми лучами. Потом, чтобы внести мутации в ген, который его кодирует, нужно определить область белка, которую нужно изменить — активный центр фермента или центр связывания с другим, антител. Копирование этой части полимеразой может переписывать ДНК быстро и с ошибками, в набор вариантов для тестирования. Другой способ создать много мутантных копий ДНК — перетасовкой (DNA shuffling) развил Уильям Стеммер — мог бы заменить лауреатов, но пять лет не дожил. Его идея рекомбинировать — перетасовывать ДНК, кодирующие один и тот же белок у разных бактерий, дает «секс в пробирке» и более разнообразные варианты белков — материал для эволюции.

Бактерии могут размножать и вирусов — бактериофагов, чья ДНК устроена еще проще, меньше и легче поддается манипуляциям, а нужные белки выходят как вирусные частицы из зараженных клеток, на «дисплей».

Джордж Смит решал другую задачу, связи НК-белков со стороны генов. Что бы определить функцию множества неопознанных генов, соотнести их с белками, он придумал встраивать их ген  в ДНК бактериофага, рядом с геном, кодирующим белок его оболочки,  их можно было обрабатывать, например, антителами и смотреть, какие из них будут связываться с белками на «стенке» — оболочке вирусов. Этот метод Смит назвал фаговым дисплеем, потому что оболочка бактериофага работает, как дисплей, демонстрирующий вшитые в него белки. А Винтер связывание антител использовал для отбора их.

Почти все научные прорывы основаны на достижениях прошлого- Джорджа Смита и Грега Винтера

Как  в физике премия больше связана с био— «оптические пинцеты и их применение в биологических системах», а 1 октября Нобелевскую премию по медицине и физиологии  присудили также иммунологам — терапии рака,  молекулы и контрольные точки иммунного ответа, защиты, с разработкой препаратов, подавляющих их. Метод Смита-Уинтера дает лекарства на основе антител, точнее и прочнее связываемых и блокирующих мишени-целевые молекулы, как адалимумаб блокирует фактор некроза опухоли — мембранную молекулу Т-лимфоцитов — сигнал гибели другим клеткам, чтобы бороться с аутоиммунными заболеваниями, как ревматоидный артрит, псориаз и другие (обратно Нобелевской премии по биологии и медицине 2018- за разработку противоположного эффекта препаратов), среди лекарств на основе антител — фагового дисплея — против системной красной волчанки, сибирской язвы, макулодистрофии и рака. Винтер в Кэмбриджском университете основал компании, вывевшую на рынок противовоспалительный препарат «Хумира» (адалимумаб), с продажами на 18,4 миллиарда долларов [3].

Метод фагового дисплея разработал Джордж Смит в 1985, вставляя в геном бактериофага M13  фрагмент, кодирующий интересующий пептид или белок, в рамки считывания одного из генов, кодирующих белки капсида Отбирают связываемые лучше, для заражения бактерий снова (видео). см.Rossant et al., 2014. Phage display and hybridoma generation of antibodies to human CXCR2 yields antibodies with distinct mechanisms and epitopes

В 1990 году команда Грега Винтера применила метод представления антител на поверхности капсида [7], а в 1991 была создана первая библиотека вариабельных фрагментов антител, без иммунизированных животных и гибридом (гибридов лимфоцитов и раковых клеток). Информация о пептидах, связывающих разные антигены, собирается в общедоступную базу данных BDB.

Он превратил метод фагового дисплея из метода изучения в метод получения необходимых белков, отбирая лучше или хуже взаимодействующие до требуемой эффективности связывания антител с антигеном [6][8–10], подобно развитию — эволюции антител в наших собственных организмах. Они как белки связаны с ДНК лимфоцитов, B-клетки, экспонирующих случайно сконструированные антитела одного-единственного типа. Если происходит связывание антигена с антителом, то B-клетка при помощи помощников превращается в плазматическую клетку, начинает интенсивно размножаться и продуцировать антитела, умножая количество антител на 8 (у человека) — 12 (у мышей) порядков, и организм успешно борется с болезнью. Методом же фагового дисплея, вручную отбирают фага с нужным фрагментом белка, чтобы размножить его в пробирке при помощи бактерий [11].

В 2002 году как лекарство для артрита в Европе и США был одобрен адалимумаб (HUMIRA), самый успешный препарат, основанный на моноклональных антителах к TNF и методе фагового дисплея, гордости  Грега Винтера [12], см. Биомолекулы «Краткая история открытия и применения антител» [13].

«Вашингтон пост» именует их «учеными, которые оседлали силу эволюции» [14], но Арнольд отличала себя от ученых, как инженер.

От случайного блуждания к направленному дизайну- методы, основанные на случайном мутагенезе с последующим отбором, — работа вслепую, за счет категорий количества и умножения (в Логике Гегеля) — мутаций в генах, встраиваемых в бактериальные векторы или геномы фагов, бактерий, размножения, поколений микроорганизмов, сменяемых за часы, не миллионы лет. Направленная эволюция подобна черному ящику и прекрасный результат остается черным, в отличие от принципиально другого, рационального пути биоинженерии белков посредством их конструирования из доменов с известными свойствами [15]. С активным задействованием данных о структуре белков и последовательностях, кодирующих их ДНК, более  перспективным [16–20]. Литература

  1. Официальный пресс-релиз Шведской Королевской Академии наук. (2018);
  2. Ouellette J. (2013). The director of evolutionSlate;
  3. Laursen L. (2018). ‘I’m not a scientist, and I’m not a gentleman.’ Frances Arnold is the fifth woman to win the Nobel Prize in chemistryFortune;
  4. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция;
  5. K. Chen, F. H. Arnold. (1993). Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide.Proceedings of the National Academy of Sciences90, 5618-5622;
  6. Christoph M. Hammers, John R. Stanley. (2014). Antibody Phage Display: Technique and ApplicationsJournal of Investigative Dermatology134, 1-5;
  7. John McCafferty, Andrew D. Griffiths, Greg Winter, David J. Chiswell. (1990). Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domainsNature348, 552-554;
  8. Биотехнология антител;
  9. 12 методов в картинках: иммунологические технологии;
  10. Враг моего врага — мой друг. Как бактерии и вирусы помогают создавать антитела для лечения человека;
  11. Greg Winter, Andrew D. Griffiths, Robert E. Hawkins, Hennie R. Hoogenboom. (1994). Making Antibodies by Phage Display TechnologyAnnu. Rev. Immunol.12, 433-455;
  12. Nobel Prize in chemistry awarded for pioneering work on proteins — live. (2018). The Guardian;
  13. Краткая история открытия и применения антител;
  14. Guarino B. (2018). Nobel Prize in chemistry goes to three scientists who harnessed ‘the power of evolution’The Washington Post;
  15. Tyler W. Johannes, Huimin Zhao. (2006). Directed evolution of enzymes and biosynthetic pathwaysCurrent Opinion in Microbiology9, 261-267;
  16. Дизайнерские ферменты на службе общества;
  17. «Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов;
  18. Лаборатория биокатализа ИБХ: дизайнерские ферменты и клоны-мятежники;
  19. Ферменты haut couture;
  20. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники

Случайность поиска говорит, как мало знаем, каковы предсказательные возможности. Премия по химии — как обычно, вне химии, как и половина премии по физике за биотехнику, упустив 18-й год для №118 Оганесяна ради биологии. Отчасти как и в экономике за учет климата (Нордхауза, соавтора Самуэльсона) и в премии мира гинекологу и жертве насилия — литературной, продолжая победы биологов.

Недолго пережил эту премию и первооткрыватель зелёного флуоресцентного белка — Нобелевский Лауреат по химии 2008 года Осаму Шимомура

См. полнее статью